清肺化痰通络方对大鼠肺纤维化的干预作用及对TGF-β1表达的影响(2)
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参见附件。
1材料和方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠72只，SPF级，体重(200±20)g，购于武汉大学试验动物中心。
1.2 实验药物制备
清肺化痰通络方由黄芩、瓜蒌、桃仁、地龙、黄芪、当归、鱼腥草(购于湖北省中医院)组成；常规水煎后,水浴浓缩药液至每1mL含生药2g，4℃保存。BLMA5(8mg/支，天津太和制药有限公司，批号：030705)，制成5mg/mL的生理盐水溶液。TGF-β1多克隆抗体(产品编号:SC-146)，由Santa Cruz Biotechnology生产，北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.3 实验模型
参照文献[1]，将大鼠麻醉，趁动物吸气瞬间，在额镜的直视下迅速将焊锡制成圆头的12号腰穿针头,通过声带插入气管约3～4cm,缓慢注入BLMA5生理盐水溶液1mL/kg。立即将大鼠直立旋转。
1.4 动物分组
模型组(24只)造模2h后，生理盐水15mL·kg-1·d-1灌胃；中药组(24只)造模2h后，清肺化痰通络方水煎剂15mL·kg-1·d-1灌胃；对照组(24只)不造模，生理盐水15mL·kg-1·d-1灌胃。灌胃前禁食4h，不禁水。各组动物分别在实验第3天、7天、14天、28天各处死6只。
1.5 标本取材处理
经0.5%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉后，称重；颈动脉放血处死，分离右肺上叶，10%甲醛溶液固定、取材、包埋、制作石蜡切片，用于HE染色和MASSON染色及肺组织TGF-β1表达检测。
1.6结果判断
1.6.1 MASSON染色 绿色为胶原纤维；橘红色为红细胞；红色为细胞浆；深蓝色为细胞核。观察各组肺内胶原纤维数量和部位。肺间质纤维化分级:0级(0分):无肺间质纤维化;1级(1分):轻度肺间质纤维化,病变范围局限在全肺20%以下;2级(2分):中度肺间质纤维化,病变范围占全肺20%～50%;3级(3分):重度肺间质纤维化,病变范围大于50%,肺泡融合,肺实质结构紊乱。
1.6.2 免疫组织化学
Sp法测定肺组织的TGF-β1表达：阴性对照片以PBS替代TGF-β1单克隆抗体。用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件，采用HUMIAS-2000医学图像分析软件，采集免疫组织化学结果图像，并进行定量分析。通过显微摄像系统放大400倍，每张切片随机选取5个视野，测定大鼠肺组织中TGF-β1阳性表达的平均灰度值，以反映各组肺组织中TGF-β1表达的变化。
1.7统计学处理
数据用±s表示，采用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理。同一时间点的3个组进行单因素方差分析，并用q检验进行不同组间的两两比较。P<0.05认为差异有统计学意义。
2结 果
2.1清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠一般状况的影响
见图1。造模后的第1、2天,大鼠的一般状况与对照组无明显差异,饮食量正常,运动活泼,被毛光泽。造模后第3天开始,模型组及中药组状况均不及对照组：表现为模型组取食、排便、活动均减少,有不同程度的耸毛、精神萎靡、反应迟钝；中药组的上述表现较轻。造模后第28天,模型组平均体重下降,而其余各组均有所增长，第 7、28天的中药组体重高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。
图1 大鼠不同时段的体重变化
2.2 HE和Masson染色光镜观察肺纤维化程度
见表1。对照组大鼠各时段肺组织结构正常,支气管、肺泡壁、肺泡结构完整，肺泡腔清晰，细胞形态均未出现明显病变, Masson染色未见增生的胶原纤维。第3天，模型组肺内可见肺泡间隔增宽、大量炎性细胞浸润肺间质等急性肺泡改变；中药组肺泡间隔轻度增宽，可见少量炎症细胞的浸润；第7天，模型组炎症病变更明显,肺内见大量炎性细胞浸润,肺泡腔内多处可见成堆的巨噬细胞，Masson染色可见少量胶原纤维增生，中药组肺内炎症稍加重，肺泡腔内偶见成堆巨噬细胞，Masson染色未见明显胶原纤维增生；第14天，模型组肺泡炎继续加重, Masson染色显示纤维组织明显增加，中药组也可见大量的炎性细胞浸润，Masson染色显示肺间质内少量纤维组织增加；第28天，模型组肺泡炎较前减轻,肺纤维化程度加重,大部分肺泡腔消失,被大量增生的成纤维细胞、胶原纤维所取代, Masson染色显示大量胶原沉积，中药组肺组织也可见胶原纤维大量增生，但仍可见部分尚存的正常肺泡结构。
TGF-β1表达的部位是细胞胞浆，主要分布于支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞和肺成纤维细胞。对照组大鼠的少数细支气管黏膜上皮细胞胞浆有TGF-β1弱阳性表达，肺间质中可见少量TGF-β1弱阳性的肺泡巨噬细胞;模型组和中药组的支气管、细支气管黏膜上皮细胞表达更明显、范围更广;在第7天，模型组肺泡腔和间质中出现成堆阳性的肺泡巨噬细胞,中药组只有少量肺泡腔和间质内有单个或成群的强阳性细胞表达出现；第14天模型组可见大量成堆的强阳性细胞，以肺泡巨噬细胞为主，中药组也可见成堆的阳性细胞，但分布较少；第28天，中药组和模型组可见散在的强阳性细胞。定量分析表明，各时段对照组、模型组、中药组间TGF-β1表达的差别有统计学意义(P<0.05)，将模型组和中药组不同时段进行比较，发现各时段差别有统计学意义( P<0.01)。见表2。
3 讨 论
肺纤维化是多种肺部疾病的共同结局，会导致呼吸衰竭，机体电解质代谢紊乱，甚至死亡。主要病理特点是早期弥漫性肺泡炎持续损伤肺部的结构和功能，最终基质胶原进行性沉积并取代正常的肺组织结构，形成肺纤维化，因此治疗肺纤维化的重点在早期对肺泡炎的抑制和干预。
清肺化痰通络方中黄芩、瓜蒌合为君药，黄芩味苦寒，入肺经，可解毒泻火,清肺热；瓜蒌味甘、微苦、性寒、归肺经，清热化痰，宽胸散结，两者相伍则肺之热痰清，气机调畅；鱼腥草味辛，性微寒，归肺经具有清热解毒，消痈排脓之功效，肺萎之人久咳入络，必兼气虚血瘀，以地龙、桃仁化瘀活血、通络，佐以黄芪、当归养血补气，与君药相配，苦寒、甘温并用，使肺热得清而不伤肺津，该方符合中医药治疗肺纤维化以清热解毒、肺肾双补、活血化瘀、寒热平调的组方原则，并在临床治疗取得了良好的效果。
光镜下观察各组大鼠肺组织HE染色切片，发现模型组大鼠经灌注BLMA5后，早期出现了肺泡炎的改变，晚期可见明显的纤维化改变，这符合肺纤维化的基本病理过程，这说明本实验模型制作是成功的。通过Masson染色，我们发现模型组在支气管黏膜下、血管壁及周围、肺泡壁、肺间质均有胶原大量沉积，而且胶原面积明显高于中药组，表明该方可以减轻纤维化的发生。
TGF-β1是组织生长、修复、炎症的重要细胞因子，在人的肺纤维化及动物肺纤维化模型中，均可见TGF-β1 及其表达的蛋白明显增高。TGF-β1可以刺激成纤维细胞活化为表达α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞(MFB)，而MFB则能合成大量Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原等ECM成分，同时TGF-β1对纤连蛋白、透明质酸、蛋白聚糖等的沉积有明显促进作用。殷宗宝[3]实验研究显示甘利欣可以通过抑制肺组织的TGF-β1的表达,并降低它在血清中的含量 ......
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